紫外可見分光光度計(jì)的校正方法

• 對(duì)于雙光束分光光度計(jì)而言在使用前必須要做基線校正(也稱為基線記憶)，對(duì)于此項(xiàng)工作的原理和操作方法許多使用者的認(rèn)識(shí)不盡相同；為此談?wù)勎覀兊恼J(rèn)識(shí)。

  
  

  (一)為何要做基線校正?

  光度計(jì)的光學(xué)系統(tǒng)基本是由光源(氘燈、鎢燈)、單色器(光柵、狹縫)、檢測(cè)器(光敏二極管、光電倍增管)等三部分組成的。在我們使用的波長(zhǎng)區(qū)域中(一般紫外可見儀器均在190nm-1100nm范圍里，)上述部件在不同的波長(zhǎng)下的響應(yīng)值(光源的發(fā)射強(qiáng)度、單色器的色散強(qiáng)度、檢測(cè)器的放大倍數(shù))均不相同；通俗地說、即使沒有樣品，儀器如果不做基線校正，那么在190nm至1100nm的范圍中，吸光值或透過率不會(huì)是一條直線，這是一種客觀的物理現(xiàn)象。

  
  

  (二)被校正的基線種類和用途

  (1)系統(tǒng)基線：

  所謂系統(tǒng)基線就是儀器固有的波長(zhǎng)范圍的總基線；例如一臺(tái)儀器出廠設(shè)計(jì)的波長(zhǎng)全程范圍是190nm至1100nm，那么它的系統(tǒng)基線就是這個(gè)范圍。一般來講，作為分析人員對(duì)一臺(tái)儀器做全程掃描測(cè)試是比較少見的；之所以要做系統(tǒng)基線的目的一般是將儀器的光學(xué)系統(tǒng)的響應(yīng)值校正到基本一致；這就類似馬拉松賽跑一樣，只要大家在同一起跑處(注意：不是起跑線)比賽，前后差幾米出發(fā)無所謂。

  
  

  (2)用戶基線：

  所謂用戶基線就是分析者自己設(shè)定的測(cè)量波長(zhǎng)區(qū)域的一段基線；由于這是分析所需要的區(qū)域，為了保證測(cè)試的準(zhǔn)確性，故用戶基線的校正是非常重要和必要的；這就類似百米賽跑一樣，運(yùn)動(dòng)員要在同一個(gè)起跑線上比賽而不能搶跑，否則無法準(zhǔn)確計(jì)算成績(jī)。

  
  

• (三)基線校正的方法

  (1) 系統(tǒng)基線：

  系統(tǒng)基線的校正較為簡(jiǎn)單，一般情況下樣品室內(nèi)不放樣品，僅做光學(xué)系統(tǒng)的校正；如果一定要使用全波段的測(cè)量那另當(dāng)別論。同時(shí)需要注意的是：系統(tǒng)基線無需經(jīng) 常校正，一般半個(gè)月或一個(gè)月校正校正一次即可。對(duì)有的儀器來說，系統(tǒng)基線校正過于頻繁反而會(huì)造成基線漂移嚴(yán)重。

  
  

  (2) 用戶基線校正：

  正確的校正方法是：

  兩只比色杯盛有空白溶液分別放置在樣品及參比光路中，校正波長(zhǎng)范圍要大于分析波長(zhǎng)范圍；例如、分析設(shè)定范圍為220nm-500nm，那么校正波長(zhǎng)就要設(shè)定為210nm-510nm；等待校正結(jié)束后再將波長(zhǎng)設(shè)定回到原來的220nm-500nm范圍。

  
  

  這種校正方法的優(yōu)點(diǎn)是：

  如果校正波長(zhǎng)與分析波長(zhǎng)*吻合一致，有可能在校正后的基線兩端出現(xiàn)大的噪聲；如果校正范圍大于實(shí)際分析范圍并掐頭去尾后可以提高分析精度。關(guān)于這種校正方法，許多使用者往往不知曉或忽略掉了。

  
  

  值得注意的是，有的儀器操作者在做基線校正時(shí)，參比一側(cè)不放參比溶液，也就是用空氣來做參比對(duì)照。這種方法在可見區(qū)對(duì)有的樣品也許有時(shí)影響不大，但在紫外區(qū)影響就會(huì)很明顯了。嚴(yán)格的說，用空氣做參比所測(cè)得的結(jié)果不是真正意義上的校正光譜。

  
  

  (四)基線校正的注意事項(xiàng)

  (1) 基線校正時(shí)要保證儀器有一定的預(yù)熱時(shí)間；

  (2) 每更換一種參比溶液后均要重新做基線校正；

  (3) 如果參比溶液的吸光度大于樣品的吸光度值時(shí)測(cè)試結(jié)果會(huì)出現(xiàn)負(fù)值，此時(shí)要考慮使用何種溶液做基線校正了。

  
  

• 紫外可見分光光度計(jì)問題處理：

  1、執(zhí)行了自動(dòng)調(diào)零后儀器處于什么狀態(tài)？

  自動(dòng)調(diào)零把當(dāng)前固定波長(zhǎng)的光度讀數(shù)調(diào)節(jié)為0或者1**%，取決于測(cè)定的方式。使用自動(dòng)調(diào)零減去了空白讀數(shù)。通常，在單個(gè)固定波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)使用自動(dòng)調(diào)零，如果是多波長(zhǎng)測(cè)定，應(yīng)該執(zhí)行基線校正。

  
  

  2、為什么執(zhí)行自動(dòng)調(diào)零后光譜仍然沒有得到有效的校正？

  因?yàn)樽詣?dòng)調(diào)零只校正一個(gè)點(diǎn)；要校正光譜范圍，需要進(jìn)行基線校正或精細(xì)的基線校正。精細(xì)的基線校正應(yīng)該定期進(jìn)行，一般每月一次，在樣品室中不必放任何容器。

  
  

  3、基線校正后儀器的狀態(tài)如何？

  基線校使時(shí)儀器在制定得波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光譜讀數(shù)調(diào)整為零。

  
  

  4、為什么基線校正不能正常起作用？

  是否樣品室中放了樣品?基線校正時(shí)有三種選擇，可確保基線校正的正常。

  ①樣品室池架內(nèi)空置(空氣對(duì)空氣)。此時(shí)校正儀器的基線，特別適合精細(xì)的基線校正。

  ②樣品池中放入溶劑，參比側(cè)空置。

  ③樣品和參比池中都放入溶劑。

  
  

  做基線校正時(shí)要考慮試劑的使用波長(zhǎng)范圍問題，因?yàn)橛械脑噭┰谀硞€(gè)波長(zhǎng)以下的吸光度值會(huì)無限大，這時(shí)去做校正會(huì)超出儀器的有效量程范圍，無法得到真正的結(jié)果。關(guān)于試劑的使用波長(zhǎng)范圍，目前一般在試劑瓶的標(biāo)簽上會(huì)有標(biāo)注。